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CRISPR/Cas系统在感染性疾病诊断中的应用

CRISPR/Cas系统在感染性疾病诊断中的应用

摘要

       成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统,作为原核生物的适应性免疫防御系统,近年来已经被开发成为一种高效的分子诊断工具,其特异、灵敏、快速、便捷等优势使得其在分子诊断领域,尤其是在感染性疾病的诊断上有着极佳的发展前景。本文旨在对CRISPR/Cas系统在感染性疾病诊断的应用现状、优势和局限以及未来的研究方向做一介绍和探讨。

感染性疾病因为其高发病率和高死亡率,严重威胁人类生命健康。尤其是传染性强、突变率高的病原体易形成大流行,是对全球公共卫生系统的巨大考验。对感染性疾病进行早期快速准确的诊断是降低其病死率,改善预后,限制传播的关键性举措,也是检验医学研究的重要内容。核酸检测是感染性疾病诊断的重点,与抗原、抗体检测相比,具有更高的灵敏度和特异度,对于早期诊断最为准确可靠[1]。然而传统的基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的核酸扩增鉴定方式对仪器、检测环境、操作人员要求较高,因此被局限在医学实验室,而且检测成本高,耗时长。这些缺点极大限制了其在感染性疾病诊断上,尤其是在医疗不发达地区暴发的新发传染病的诊断上的应用。理想的病原体核酸检测方式应该是准确、灵敏、快速、廉价、便携,并且能在各种环境下对任何病原体进行检测,目前还没有这样一种完全理想化的核酸检测平台。

      近年来,基于成簇间隔的短回文重复序列及其关联蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas)的新型分子诊断工具,似乎具有成为这样理想化核酸检测平台的潜力。其相较于传统的基于PCR的核酸检测方式,不仅表现出了同样优异的特异度和灵敏度,而且更加省时,对设备、操作人员及环境要求更低,还能开发为试纸用于即时检验,诸多优势更加贴合感染性疾病诊断的要求。这一技术方兴未艾,有望成为下一代感染性疾病分子诊断的尖兵利器[2]。本文旨在对基于CRISPR/Cas的分子诊断平台在感染性疾病诊断上的应用现状、优势和局限以及未来研究方向做一述评,希望能为CRISPR技术在感染性疾病诊断上的发展提供一些有价值的梳理和总结。
一、CRISPR/Cas系统简介
      CRISPR/Cas系统是一种原核生物用来抵抗外来遗传物质入侵的适应性免疫防御系统,在分子水平上,该系统通过适应、成熟和干扰3个阶段发挥免疫功能。在第一步,当有噬菌体或病毒入侵时,细菌免疫防御机制激活,剪切入侵基因片段并将其整合到CRISPR序列中,以便下一次入侵时,细菌能再次识别。在表达阶段,间隔序列翻译成包含有入侵序列的 CRISPR核糖核酸(CRISPR RNA,crRNA)和反式激活RNA(trans-activating crRNA, tracrRNA),两者通过碱基配对形成向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),用于Cas蛋白的募集,最后一步,sgRNA和Cas蛋白结合形成复合物,sgRNA通过序列互补来捕捉靶标,Cas蛋白则发挥活性内切酶活性进行切割,从而清除外来遗传物质,发挥免疫作用[3]。理论上,通过控制sgRNA的序列,CRISPR/Cas可以识别任何序列,这是其能在基因编辑、分子诊断领域得到广泛应用的基础。目前已经发现了2类、6种亚型CRISPR-Cas系统。1类CRISPR/Cas系统利用crRNA和多效应复合物来识别和切割靶序列,而2类系统利用单个多结构域Cas蛋白和crRNA发挥作用。由于2类CRISPR/Cas系统简单高效且易于控制,已广泛应用于基因编辑和分子诊断,包括Ⅱ型(即cas9)、Ⅴ型(即Cas12a和Cas12b)和Ⅵ型(即Cas13a和Cas13b)[4]。CRISPR特异性识别切割靶序列的能力最开始被用于基因编辑领域,在这个过程中,有学者利用Cas9的特性,结合等温扩增等技术将其用于病原体的检测。但直到2016年Cas12和Cas13附属切割活性的发现,才使得这一技术在分子诊断领域开始了飞速的发展。这种附属切割活性是指,Cas蛋白一旦在sgRNA的指引下捕捉到了靶序列,其被激活切割靶序列的同时,还会以极高的效率切割周围环境中的核酸片段,这样的特点使得其自带信号放大的功能,并且围绕这一特性可以设计诸多新颖的信号读出方式。另外值得注意的是,Cas9和Cas12识别切割靶序列均需要前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)的协助,例如SpCas9需要NGG序列,LbCas12需要TTTN序列,当靶序列附近没有合适的PAM序列时,会限制其运用,尤其是在单核苷酸多态性的识别及其他短序列的检测上。学者们在扩增靶标时,使用一个包含PAM序列的引物,人为在扩增产物上加上PAM序列,则解决了这一问题[5]。同样Cas13对RNA的识别有侧翼位点(protospacer flanking sequence, PFS)序列要求,即靶标前不能有G碱基,则可以通过转换间隔序列解决[6]。这些策略进一步扩展了其在检测上的应用范围。

二、CRISPR/Cas系统在感染性疾病诊断中的应用研究现状
       CRISPR/Cas9、Cas12、Cas13已被开发成多种分子诊断策略用于各种病原体,包括细菌和病毒的核酸检测,尤其是利用Cas12、Cas13的附属切割活性开发出的SHERLOCK系列、HOLMES系列和DETECTR等检测平台,为感染性疾病的快速诊断提供了新的契机。
1.基于CRISPR/(d)Cas9 的感染性疾病核酸检测平台:CRISPR/Cas9由于具有精确的靶标序列识别和切割的能力,因此具有开发成分子诊断工具的潜力。Pardee等[7]在2016年结合Cas9和NASBA(核酸依赖性扩增检测技术),借toehold生物传感器开发出一种恒温可视化的检测平台,用于肉眼检测寨卡病毒,并利用其识别单核苷酸多态性的能力用于美洲寨卡和非洲寨卡的基因分型。Huang等[8]开发了一种CAS-EXPAR平台,将Cas9切割后的产物作为引物,利用指数扩增反应(exponential amplification reaction, EXPAR)进行扩增,之后对产物进行荧光显色(图1A)。该平台能够在1 h内检测李斯特菌,并且具有阿摩尔级别(10-18/L)的灵敏度和单碱基分辨的特异度。